超高速原子力顯微鏡HS-AFM+NanoDSF觀察TRPV3通道五聚體

超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學(xué) Prof. Ando 教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)，日本RIBM公司（生體分子計(jì)測(cè)研究所株式會(huì)社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業(yè)化的產(chǎn)品，可以達(dá)到視頻級(jí)成像的商業(yè)化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測(cè)。超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號(hào)，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今已有150多位用戶，發(fā)表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等雜志。

相較于目前市場(chǎng)上的原子力顯微鏡成像設(shè)備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢"的限制，掃描速度高可達(dá) 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺(tái)可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測(cè)。液體環(huán)境下直接檢測(cè)，超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數(shù)小，避免了對(duì)生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動(dòng)漂移校準(zhǔn)，適用于長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)。采用動(dòng)態(tài)PID控制，高速掃描時(shí)仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。

HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級(jí)別分辨率，而且具有操作的簡(jiǎn)易性，使得對(duì)單分子動(dòng)態(tài)過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研究和理解生物物理、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、病毒學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的單分子動(dòng)態(tài)過程提供了一款強(qiáng)大的工具。全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構(gòu)，更低噪音、更高穩(wěn)定性的控制器，高速掃描器，緩沖防震設(shè)計(jì)，主動(dòng)阻尼，動(dòng)態(tài)PID，驅(qū)動(dòng)算法優(yōu)化，多種前沿技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統(tǒng)整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動(dòng)化的設(shè)置使得研究人員可以專注于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不需要復(fù)雜的操作和條件設(shè)置，快速獲取數(shù)據(jù)，加速研究的產(chǎn)出。

目前已經(jīng)解析了大量的瞬時(shí)受體電位通道TRP(transient receptor potential)家族的結(jié)構(gòu)，顯示都是四聚體，但關(guān)于TRPV通道的許多方面仍然知之甚少，包括孔膨脹現(xiàn)象（pore-dilation phenomenon）?？茖W(xué)家通過超高速原子力顯微鏡HS-AFM，在單分子水平上分析了膜嵌入的TRPV3，并發(fā)現(xiàn)了一種五聚體狀態(tài)。并且通過NanoDSF進(jìn)一步探究了 DPBA對(duì)TRPV3四聚體狀態(tài)的破壞作用。

基因組DNA折疊形成環(huán)狀以及拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域（Topologically associating domains，TADs），從而組成了基因組復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，這些三維結(jié)構(gòu)具有重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)控作用。先前的研究已經(jīng)逐漸揭示出基因組結(jié)構(gòu)是由染色體結(jié)構(gòu)維持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白復(fù)合物所介導(dǎo)的環(huán)擠出（DNA loop extrusion）過程形成的（圖1）。單分子層面的研究表明SMC蛋白復(fù)合體和Cohesin蛋白的確能夠?qū)NA擠壓形成環(huán)狀。因此，關(guān)于基因組的三維結(jié)構(gòu)形成研究者們提出了“環(huán)擠出假說"，認(rèn)為染色體結(jié)構(gòu)維持的SMC復(fù)合物組織就基因組的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并通過環(huán)擠出來實(shí)現(xiàn)這一功能。但是這一過程的具體細(xì)節(jié)是如何進(jìn)行的還不得而知。

瞬時(shí)受體電位（TRP）通道是一個(gè)龐大的真核離子通道超家族，控制著多種生理功能，因此是具吸引力的藥物靶點(diǎn)。目前已確定了來自 20 多種不同 TRP 通道的 210 多種結(jié)構(gòu)，且均為四聚體。盡管有如此豐富的結(jié)構(gòu)信息，但關(guān)于 TRPV 通道的許多方面仍知之甚少，包括孔道擴(kuò)張現(xiàn)象，即長(zhǎng)時(shí)間激活會(huì)導(dǎo)致電導(dǎo)增加、對(duì)大離子的通透性增強(qiáng)以及整流性喪失。在此，我們利用日本RIBM公司的超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡（HS-AFM，SS-NEX）在單分子水平上分析了嵌入膜的 TRPV3，并發(fā)現(xiàn)了一種五聚體狀態(tài)。HS-AFM 動(dòng)態(tài)成像顯示，五聚體在與經(jīng)典四聚體的動(dòng)態(tài)平衡中具有短暫性和可逆性，通過膜擴(kuò)散亞基交換實(shí)現(xiàn)。加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，五聚體的群體增加，DPBA 是一種已被證明可誘導(dǎo) TRPV3 孔道擴(kuò)張的激動(dòng)劑。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一條蛋白質(zhì)生產(chǎn)和數(shù)據(jù)分析流程，最終獲得了 TRPV3 的冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)。五聚體，其孔徑比四聚體大。進(jìn)入和退出五聚體狀態(tài)的緩慢動(dòng)力學(xué)、加入 DPBA 后五聚體形成的增加以及孔徑的擴(kuò)大表明，五聚體代表了孔徑擴(kuò)張的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。因此，我們展示了膜擴(kuò)散原體交換作為結(jié)構(gòu)變化和構(gòu)象變異性的一種額外機(jī)制。總的來說，我們?yōu)榉堑湫偷奈寰垠w TRP 通道組裝提供了結(jié)構(gòu)證據(jù)，為 TRP 通道研究開辟了新的方向。

結(jié)果：

（1）：將蛋白質(zhì)脂質(zhì)體沉積在新切割的云母上，并在緩沖溶液中成像，通過HS-AFM視頻，發(fā)現(xiàn)在典型四聚體通道旁邊檢測(cè)到五聚體TRPV3。

（2）：觀察到29個(gè)明確的TRPV3四聚體-五聚體或五聚體-四聚體轉(zhuǎn)換過程（12 + 11 + 6）,65個(gè)只有TRPV3五聚體的狀態(tài)。作者在320μM二苯基硼酸酐（DPBA）存在的情況（DPBA是一種配體，之前已被證明可以誘導(dǎo)TRPV3中的孔膨脹）下通過HS-AFM對(duì)TRPV3進(jìn)行了成像。

（3）：為了進(jìn)一步探究 DPBA 對(duì) TRPV3 四聚體狀態(tài)的破壞作用，我們進(jìn)行了納米差示掃描熒光法（nanoDSF）實(shí)驗(yàn)，并通過監(jiān)測(cè) 350 和/或 330 納米處熒光發(fā)射隨溫度的變化來測(cè)量 TRPV3 的熱穩(wěn)定性。在 nanoDSF 實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量的是蛋白質(zhì)中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的固有熒光，其會(huì)因局部環(huán)境的變化而改變，例如溫度依賴性的構(gòu)象變化、寡聚體解離和/或變性。TRPV3 的熱變性曲線顯示出兩個(gè)一階導(dǎo)數(shù)峰，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)熔解溫度，DI YI個(gè)熔解溫度（Tm1）表現(xiàn)為反向藍(lán)移曲線，在 55.5 ± 0.1°C 處有一個(gè)拐點(diǎn)，第二個(gè)熔解溫度（Tm2）在 63.4 ± 0.3°C 處有一個(gè)拐點(diǎn)（圖 4c，d）。值得注意的是，當(dāng)向同一蛋白質(zhì)樣品中加入 320 μM DPBA 時(shí)，Tm1 降至 52.7 ± 0.6°C，Tm2 降至 61.3 ± 0.5°C。而當(dāng)分別加入 32 和 100 μM DPBA 時(shí)，這些配體濃度已被證明可誘導(dǎo)典型的盡管激活了電流但并未增強(qiáng)次級(jí)電流 25，熔點(diǎn)更接近于無配體狀態(tài)，即 Tm1 和 Tm2 分別為 55.1 ± 0.5 和 54.5 ± 0.3 攝氏度以及 63.1 ± 0.3 和 62.6 ± 0.6 攝氏度（圖 4c，d）。最后，當(dāng)向樣本中加入 1000 μM 的 DPBA（一種已被證實(shí)會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)電性崩潰的配體）時(shí)，觀察到穩(wěn)定性進(jìn)一步顯著下降，Tm1 和 Tm2 分別為 51.3 ± 1.0 和 60.5 ±0.3°（圖 4c、d）。在 350 納米和 330 納米處的熒光紅移表明內(nèi)部色氨酸暴露，而熒光藍(lán)移則內(nèi)部色氨酸缺失或在熱變性過程中內(nèi)部酪氨酸的暴露相關(guān)。通過檢查 TRPV3 結(jié)構(gòu)中酪氨酸和色氨酸的分布，我們發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)部隱藏的色氨酸和酪氨酸，特別是許多隱藏在亞基界面處的酪氨酸（補(bǔ)充圖 4）。這使我們推測(cè) Tm1 對(duì)應(yīng)于 TRPV3 低聚物的解體，表現(xiàn)為亞基界面處的酪氨酸暴露，而 Tm2 對(duì)應(yīng)于 TRPV3 單體的變性。另一種解釋可能是 Tm1 與溫度感應(yīng)構(gòu)象變化有關(guān)，而 Tm2 與單體斷裂和變性有關(guān)。無論具體事件的順序如何，DPBA 顯然影響了單體界面的完整性并使通道不穩(wěn)定。因此，這些結(jié)果與我們?cè)谔砑?DPBA 后通過 HS-AFM 觀察到的四聚體減少和 TRPV3 片段增加是一致的。

結(jié)果：
HS-AFM

將 2 微升的 TRPV3 重組囊泡液滴置于 1.5 平方毫米的新鮮云母表面，該表面用紫外線膠粘在石英樣品臺(tái)上。在濕度室中孵育 5 分鐘后，用成像緩沖液（無配體（apo）條件：20 毫摩爾 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩爾 NaCl；孔擴(kuò)張條件：20 毫摩爾 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩爾 NaCl 和 320 微摩爾 DPBA）輕輕沖洗樣品臺(tái)上的樣品，然后將其安裝在 HS-AFM 液體池中。在 150 毫摩爾 NaCl 存在的情況下，一個(gè)薄薄的緩沖液層（約 5 埃）將支撐膜與云母基底隔開，使膜蛋白能夠擴(kuò)散，如本文中 TRPV3 通道在密集膜中的橫向和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)所顯示的那樣。在室溫下使用 HS-AFM（SS-NEX，日本RIBM公司）以振幅調(diào)制模式拍攝圖像，該模式具有優(yōu)化的掃描和反饋參數(shù)，并使用 IgorPro RIBM 軟件（Ibis v.1.1.0，IgorPro v.6.3.7.2）。使用了標(biāo)稱彈簧常數(shù)為 0.15 牛頓/米、共振頻率約為 650 千赫茲、在緩沖液中的品質(zhì)因數(shù)約為 1.5 的超短（8 微米）懸臂（USC-F1.2-k0.15，NanoWorld）。IgorPro v.8（WaveMetrics）用于高掃描速率原子力顯微鏡（HS-AFM）數(shù)據(jù)采集。采用氧等離子體蝕刻來銳化針尖。HS-AFM 圖像以每秒 0.5 至 3 幀的速度采集，像素采樣率為每像素 1.25 至 8 埃。在非常相似的條件下進(jìn)行的 HS-AFM 成像已用于分析其他幾種膜蛋白的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)，如 OmpG、AqpZ、ec-CLC、GltPh、CorA、Piezo-1 和 GLIC42，51–57，但從未觀察到像此處記錄的 TRPV3 這樣的寡聚化變化。HS-AFM 視頻對(duì)齊、平整化和橫截面分析、高度分布和徑向輪廓分析均在 ImageJ 中完成。

NanoDSF

使用 NanoDSF 技術(shù)對(duì)在 HEK293S GnTI? 細(xì)胞中表達(dá)的純化 TRPV3 進(jìn)行了熱變性曲線測(cè)量，所用樣品為從尺寸排阻色譜柱中獲得的對(duì)應(yīng)純四聚體的峰組分，將其稀釋至 3.3 μM 濃度（在 20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM βME 和 0.01%（w/v）GDN 中）。在無配體條件下以及分別加入 32（n = 6 次生物獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）、100（n = 6）、320（n = 7）和 1，000 μM（n = 6）DPBA 后進(jìn)行了測(cè)量，使用 Tycho NT.6儀器，按照制造商的說明進(jìn)行操作。采用單側(cè)不等方差（Welch）t 檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明加入 320 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 均顯著降低（99%置信水平，P = 0.000038 和 0.00190），而加入 1，000 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 進(jìn)一步降低（P = 0.015（95%置信水平）和 0.0043（99%置信水平）。

參考文獻(xiàn)：

Shifra Lansky, John Michael Betancourt, Jingying Zhang, Yining Jiang, Elizabeth D. Kim

A pentameric TRPV3 channel with a dilated pore

206 | Nature | Vol 621 | 7 September 2023

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蛋白穩(wěn)定性分析儀—PSA-16；單分子穩(wěn)定性分析儀（磁鑷力譜測(cè)量?jī)x）—HiMT；單分子質(zhì)量光度計(jì)—TwoMP；超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡—HS-AFM；微流控?cái)U(kuò)散測(cè)量?jī)x—Fluidity One-M；

微納加工點(diǎn)印儀—NLP2000/DPN5000；臺(tái)式原子力顯微鏡—ACST-AFM；全自動(dòng)半導(dǎo)體式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀—SOL COUNT；農(nóng)藥殘留定量檢測(cè)儀—BST-100；