超高速原子力顯微鏡HS-AFM+質(zhì)量光度計(jì)觀察粘連蛋白介導(dǎo)DNA環(huán)擠出

超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學(xué) Prof. Ando 教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)，日本RIBM公司（生體分子計(jì)測(cè)研究所株式會(huì)社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業(yè)化的產(chǎn)品，可以達(dá)到視頻級(jí)成像的商業(yè)化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測(cè)。超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號(hào)，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，已有150多位用戶，發(fā)表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等雜志。

相較于目前市場(chǎng)上的原子力顯微鏡成像設(shè)備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢"的限制，掃描速度高可達(dá) 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺(tái)可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測(cè)。液體環(huán)境下直接檢測(cè)，超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數(shù)小，避免了對(duì)生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動(dòng)漂移校準(zhǔn)，適用于長時(shí)間觀測(cè)。采用動(dòng)態(tài)PID控制，高速掃描時(shí)仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。

HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級(jí)別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對(duì)單分子動(dòng)態(tài)過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研究和理解生物物理、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、病毒學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的單分子動(dòng)態(tài)過程提供了一款強(qiáng)大的工具。全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構(gòu)，更低噪音、更高穩(wěn)定性的控制器，高速掃描器，緩沖防震設(shè)計(jì)，主動(dòng)阻尼，動(dòng)態(tài)PID，驅(qū)動(dòng)算法優(yōu)化，多種前沿技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統(tǒng)整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動(dòng)化的設(shè)置使得研究人員可以專注于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不需要復(fù)雜的操作和條件設(shè)置，快速獲取數(shù)據(jù)，加速研究的產(chǎn)出。

基因組DNA折疊形成環(huán)狀以及拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域（Topologically associating domains，TADs），從而組成了基因組復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，這些三維結(jié)構(gòu)具有重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)控作用。先前的研究已經(jīng)逐漸揭示出基因組結(jié)構(gòu)是由染色體結(jié)構(gòu)維持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白復(fù)合物所介導(dǎo)的環(huán)擠出（DNA loop extrusion）過程形成的（圖1）。單分子層面的研究表明SMC蛋白復(fù)合體和Cohesin蛋白的確能夠?qū)NA擠壓形成環(huán)狀。因此，關(guān)于基因組的三維結(jié)構(gòu)形成研究者們提出了“環(huán)擠出假說"，認(rèn)為染色體結(jié)構(gòu)維持的SMC復(fù)合物組織就基因組的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并通過環(huán)擠出來實(shí)現(xiàn)這一功能。但是這一過程的具體細(xì)節(jié)是如何進(jìn)行的還不得而知。

奧地利維也納生物中心 (VBC)分子病理學(xué)研究所Jan-Michael Peters研究組發(fā)現(xiàn)粘連蛋白通過“擺動(dòng)和鉗夾"機(jī)制介導(dǎo) DNA 環(huán)擠出。2021年10月7日出版的《細(xì)胞》雜志發(fā)表了這一成果。作者分析了人類粘連蛋白-NIPBL 復(fù)合物如何介導(dǎo)環(huán)擠出，并使間期細(xì)胞中的染色質(zhì)折疊。 他們已經(jīng)確定了環(huán)擠出所需的 DNA 結(jié)合位點(diǎn)和大規(guī)模構(gòu)象變化，并確定了這些是如何協(xié)調(diào)的。他們的結(jié)果表明 DNA 通過自發(fā)的 50 nm 擺動(dòng)的粘連蛋白鉸鏈轉(zhuǎn)移，將 DNA 交給 SMC3 的 ATPase 頭部，在那里結(jié)合 ATP，然后DNA 被 NIPBL 夾住。

在這個(gè)過程中，NIPBL 從鉸鏈“跳躍"到 SMC3 頭部，從而可能將自發(fā)鉸鏈擺動(dòng)與 ATP 依賴性 DNA 夾緊結(jié)合起來。 這些結(jié)果揭示了粘連蛋白-NIPBL 和可能的其他染色體結(jié)構(gòu)維持 (SMC)復(fù)合物如何介導(dǎo)環(huán)擠出的機(jī)械原理。

該實(shí)驗(yàn)過程通過借助日本RIBM公司研發(fā)的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM來完成，HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠?qū)崿F(xiàn)在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。待測(cè)樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測(cè)。

目前，一些體外的生化重構(gòu)實(shí)驗(yàn)一定程度上已經(jīng)證實(shí)了環(huán)擠出假說，這些結(jié)果證明SMC蛋白與Cohesin蛋白會(huì)以2.1kb/s的速度擠壓DNA，并且這一過程依賴于ATP酶活性（圖2）。但限于實(shí)驗(yàn)分辨率等問題，環(huán)擠出的過程是如何實(shí)現(xiàn)的具體細(xì)節(jié)還不得而知。

DNA環(huán)擠出過程中具體的構(gòu)象變化是如何發(fā)生的呢？為了揭開這一過程的全貌，作者們應(yīng)用了高速原子力顯微鏡（High-speed atomic force microscopy，HS-AFM）對(duì)Cohesin進(jìn)行了實(shí)時(shí)成像。

在ATP存在的情況下的，Cohesin三聚體復(fù)合物中會(huì)在環(huán)狀、桿狀以及彎曲狀構(gòu)象之間的變化。作者們發(fā)現(xiàn)DNA是通過Cohesin蛋白鉸鏈的彎曲進(jìn)而易位的，這樣將DNA轉(zhuǎn)移到SMC3的ATP酶活性頭部，在該位置與ATP結(jié)合，DNA被NIPBL夾住。在此過程中NIPBL從鉸鏈向SMC3頭部移動(dòng)，引發(fā)鉸鏈區(qū)域的自發(fā)擺動(dòng)以及ATP依賴的DNA結(jié)合，從而形成一個(gè)循環(huán)，使得DNA從鉸鏈延伸到SMC3的頭部，在此循環(huán)周期的末尾，DNA片段可以轉(zhuǎn)移到SMC1的頭部。由此，作者們提出了DNA環(huán)擠出的“擺-夾"“Swing and clamp"模型，這類似于抓娃娃機(jī)的小爪子，可以將通過鉸鏈的彎曲伸出機(jī)械手“抓住"DNA，然后上提，從而通過一次次循環(huán)促使DNA逐步環(huán)擠出。

結(jié)果：

（1）：人黏連蛋白由四個(gè)亞基組成：SMC1，SMC3，Scc1和STAG1。SMC1和SMC3通過它們的鉸鏈結(jié)構(gòu)域異二聚化。SMC1-SMC3鉸鏈異二聚體與STAG1的“ U"的底部直接接觸，DNA首先由NIPBL和STAG1募集到處于SMC1和SMC3頭部結(jié)構(gòu)域分離狀態(tài)的黏連蛋白，ATP結(jié)合后，Scc1連接SMC1和SMC3的ATPase頭部結(jié)構(gòu)域形成環(huán)，并將DNA捕獲在SMC隔室內(nèi)。然后，NIPBL和STAG1包裹在DNA周圍，形成中ZHONG央通道并進(jìn)一步包裹DNA。

（2）：通過TwoMP質(zhì)量光度法（單分子質(zhì)量光度計(jì)分析系統(tǒng)）證實(shí)了SMC1和SMC3頭部結(jié)構(gòu)域（SMC1HD、SMC3HD）可以各自結(jié)合單個(gè)DNA分子作為單體：在存在ATP的前提下，對(duì)SMC1HD和SMC3HD含和不含40堿基對(duì)（bp）雙鏈（ds）DNA進(jìn)行質(zhì)量光度分析,負(fù)質(zhì)量對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物在兩幀之間從表面解離的事件。

（3）：冷凍電鏡Cryo-EM在不同的構(gòu)象中觀察到了黏連蛋白，但尚不清楚哪些在天然條件下存在，以及黏連蛋白如何從一種構(gòu)象變化到另一種構(gòu)象。因此，作者通過超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡HS-AFM實(shí)時(shí)成像黏連蛋白。為了確定哪些亞基和結(jié)構(gòu)域可以通過HS-AFM可視化，作者分析了在含有SMC1、SMC3和SCC1的三聚體及結(jié)合到NIPBL（N）的三聚體，以及含有SMC1、SMC3和SCC1和STAG1（S）的四聚體及結(jié)合到NIPBL的四聚體，圖F中顯示了對(duì)應(yīng)于鉸鏈（hi）、頭部（he）、NIPBL（N）和STAG1（S）的密度。

（4）：隨后通過質(zhì)量光度法測(cè)定的二聚體（SMC1、SMC3）和三聚體（SMC1、SMC3和SCC1）的質(zhì)量分布，可以證實(shí)這些復(fù)合體中含有SCC1，并且二聚體（286 kDa）和三聚體（399 kDa）的理論質(zhì)量與測(cè)量值非常一致（圖G、H）。質(zhì)量光度法（Mass Photometry）是一種革命性的分子分析新方法。它能夠準(zhǔn)確測(cè)量溶液中天然狀態(tài)下的單個(gè)分子的質(zhì)量數(shù)，無需標(biāo)記，為生物分析和生物分子功能研究開辟了新的途徑。其原理是：粒子散射的光信號(hào)與粒子的體積和折射率成線性關(guān)系。由于生物分子的光學(xué)性質(zhì)和密度僅有百分之幾的差別，所以散射信號(hào)也就與分子的質(zhì)量成正比，因此可以用光稱量單個(gè)分子。散射信號(hào)與質(zhì)量的相關(guān)性適用于各種生物分子（例如糖蛋白、核酸和/或脂質(zhì)），這使得質(zhì)量光度法成為溶液中生物分子的通用分析工具。

（5）：在ATP存在下，（SMC1、SMC3和SCC1）三聚體復(fù)合物方式上在環(huán)狀（rings）、棒狀（rods）和扭曲（bent）構(gòu)象之間交替出現(xiàn)（圖I）。在環(huán)形復(fù)合體中，卷曲的線圈被拉伸但彼此分開，而頭部結(jié)構(gòu)域要么相互接觸，代表ATP接合狀態(tài)；要么頭部結(jié)構(gòu)域脫離，代表ATP非接合狀態(tài)。在桿狀復(fù)合體中，頭部結(jié)構(gòu)域脫離，線圈對(duì)齊；在許多情況下，相互扭曲（圖I），在這種狀態(tài)下，鉸鏈有時(shí)會(huì)短暫打開。

（6）：（SMC1、SMC3和SCC1）三聚體復(fù)合物在接合和脫離狀態(tài)之間振蕩，在后一種構(gòu)造中，可以對(duì)齊和彎曲其線圈（圖K，head movement，coil alignment）；當(dāng)STAG1和NIPBL與三聚體結(jié)合時(shí)，也觀察到類似的變化；當(dāng)線圈折疊成彎曲是不對(duì)稱狀態(tài)時(shí)，鉸鏈靠近一個(gè)頭部，但不靠近另一個(gè)頭部（圖K，hinge bending，鉸鏈彎曲）。

討論：

由染色體結(jié)構(gòu)維持SMC蛋白復(fù)合物所介導(dǎo)的DNA環(huán)的擠出過程仍然是一個(gè)迷，這一過程被認(rèn)為具有重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)控功能。作者通過超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡HS-AFM實(shí)時(shí)成像技術(shù)首SHOU次深入了解了人類粘連蛋白-NIPBL復(fù)合物易位DNA以介導(dǎo)DNA環(huán)擠出的機(jī)制原理，并可能對(duì)理解其他SMC復(fù)合物如何發(fā)揮這一功能具有更廣泛的意義。

作者通過超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡實(shí)時(shí)成像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cohesin促使的DNA環(huán)擠出過程的全紀(jì)錄，從而能夠?qū)NA從一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)帶到另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，揭開了SMC復(fù)合體進(jìn)行基因組的折疊的以及促進(jìn)復(fù)雜基因組三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形成的機(jī)制。通過質(zhì)量光度法測(cè)定的二聚體（SMC1、SMC3）和三聚體（SMC1、SMC3和SCC1）的質(zhì)量分布。

參考文獻(xiàn)：

Benedikt W. Bauer, et al. Cohesin mediates DNA loop extrusion by a“swing and clamp"mechanism. Cell 184, 5448–5464, October 14, 2021.

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